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通風柜,實驗室通風櫥,實驗室邊臺,實驗室中央臺,萬能材料試驗機,實驗室通風柜

技術文章

總RNA的提取(Trizol法提取)


 RNA的提取(Trizol法提取)

在收集到生物材料之后,*好能即刻進行RNA制備工作。若需暫時儲存,則應以液氮將生物材料急速冷凍后,儲存于-80℃冷凍柜。在制備RNA時,將儲存于冷凍柜的材料取出,立即以加入液氮研磨的方式打破細胞,不可以先行解凍,以避免RNase的作用。

1.      提取組織RNA時,每50100mg組織用1ml Trizol試劑對組織進行裂解;提取細胞RNA時,先離心沉淀細胞,每5-10 106個細胞加1ml Trizol后,反復用槍吹打或劇烈振蕩以裂解細胞;

2.      將上述組織或細胞的Trizol裂解液轉入EP管中,在室溫15~30C下放置5分鐘;

3.      在上述EP管中,按照每1ml TRIZOL0.2ml氯仿的量加入氯仿,蓋上EP管蓋子,在手中用力震蕩15秒,在室溫下(15℃30℃)放置23分鐘后,12000g2℃8℃)離心15分鐘;

4.      取上層水相置于新EP管中,按照每1ml TRIZOL0.5ml異丙醇的量加入異丙醇,在室溫下(15℃30℃)放置10分鐘,12000g2℃8℃)離心10分鐘;

5.      棄上清,按照每1ml TRIZOL1ml 75%乙醇進行洗滌,渦旋混合,7500g2℃8℃)離心5分鐘,棄上清;

6.      讓沉淀的RNA在室溫下自然干燥;

7.       Rnase-free water 溶解RNA沉淀。                       

PCR

實驗室常用DNA聚合酶有三種:TaKaRa TaqTMTaKaRa EXTaqTMPyrobestTM DNA PolymeraseTaKaRa TaqTM是一般的DNA聚合酶,保真性較差,但價錢便宜,一般用于基因表達的檢測等。TaKaRa EXTaqTM是具有Proof reading活性的耐熱性DNA聚合酶,具有一定的保真性,而且其擴增得到的PCR產物3’端附有一個“A”堿基,如果希望直接將產物克隆到T-vector可以用此酶。PyrobestTM DNA Polymerase也是具有Proof reading活性的耐熱性DNA聚合酶,其特點是保真性極高,擴增得到的PCR產物為平滑末端。如果進行基因的擴增請使用此酶。

1.      按下列組成在PCR反應管中調制反應液:

TaKaRa TaqTMTaKaRa EXTaqTM的配方

Reagent

Quantity, for 50µl of reaction mixture

10X PCR buffer Mg2+ free

5 µl

MgCl225mM

TaKaRa TaqTM3 µl

TaKaRa EXTaqTM4 µl

2.5mM dNTP mix

4 µl

10µM Primer 上游

1 µl

10µM Primer下游

1 µl

Template DNA

1 µl

TaqEXTaqDNA Polymerase

0.25 µl

Sterile deionized water

Up to 50µl

Total

50 µl /Sample

PyrobestTM DNA Polymerase的配方

Reagent

Quantity, for 50µl of reaction mixture

10X Pyrobest buffer

5µl

2.5mM dNTP mix

4µl

10µM Primer上游

1µl

10µM Primer 下游

1µl

Template DNA

1µl

PyrobestTM DNA Polymerase

0.25µl

Sterile deionized water

Up to 50µl

Total

50µl /Sample

 

    反應總體積根據實際情況進行調控,可以做20~50µl以節約試劑;

    將上表各成分加入到0.2ml0.5ml**的PCR薄壁管中;

    如果不用PCR儀的加熱蓋,在反應混合液的上層加30 ~50µl 的礦物油防止樣品在PCR的過程中蒸發;

2.      按以下程序進行PCR擴增。

PCR反應條件視模板、引物等的結構條件不同而各異,在實際操作中需根據具體的情況以及PCR結果而進行優化。

Step

Temperature, °C

Time, min

Number of cycles

Note

起始變性

94~95

1-3

1

 

變性

94~95

0.5-2

25-35

退火溫度比理論退火溫度大概低5°C,再根據反應結果優化

退火

37-70

0.5-2

延伸

70-75

根據擴增產物的大小

每分鐘延伸1000bp

*終延伸

70-75

10

1

 

 

反應結束后,抽取擴增樣品5µl,用瓊脂糖凝膠電泳分析擴增結果,用DNA marker判斷擴增片段的大小或冷凍保存,以備以后分析使用。

RT-PCR

Protocol: TaKaRa One Step RNA PCR Kit (AMV)

  1. 按下列組成在PCR反應管中調制反應液

Reagent

Quantity, for 50µl
of reaction mixture

10×One Step RNA PCR Buffer

5µl

25 mM MgCl2

10µl

10 mM dNTP mix

5µl

RNase Inhibitor (40 U/µl)

1µl

AMV-Optimized Taq

1µl

AMV RTase XL (5 U/µl)

1µl

上游特異Primer (20 µM)

1µl

下游特異Primer (20 µM)

1µl

實驗樣品RNA≤1 µg Total RNA

1µl

RNase Free dH2O

24µl

Total

50µl /Sample

1.      反應總體積根據實際情況進行調控,可以做20~50µl以節約試劑;

2.      將上表各成分加入到0.2ml0.5ml**的PCR薄壁管中;

3.      如果不用PCR儀的加熱蓋,在反應混合液的上層加30 ~50µl 的礦物油防止樣品在PCR的過程中蒸發;

2.按以下條件進行反應

Step

Temperature, °C

Time, min

Number of cycles

Note

逆轉錄

50

30

1

 

逆轉錄酶失活

94

2

1

 

變性

94

0.5

25-35

 

退火

37-65

0.5

退火溫度比理論退火溫度大概低5°C,再根據反應結果優化

延伸

72

根據擴增產物的大小

Taq每分鐘延伸1000bp

*終延伸

72

10

1

 

反應結束后,抽取擴增樣品5µl,用瓊脂糖凝膠電泳分析擴增結果,用DNA marker判斷擴增片段的大小或冷凍保存,以備以后分析使用。

瓊脂糖核酸電泳

1.        用蒸餾水將制膠模具和梳子沖洗干凈,放在制膠平板上,封閉模具邊緣,架好梳子;

2.        根據欲分離DNA片段大小用凝膠緩沖液配制適宜濃度的瓊脂糖凝膠:準確稱量瓊脂糖干粉,加入到配膠用的三角燒瓶內,定量加入電泳緩沖液(一般20~30 ml);

3.        放入到微波爐內加熱熔化。冷卻片刻,加入一滴熒光染料,輕輕旋轉以充分混勻凝膠溶液,倒入電泳槽中,待其凝固;

4.        室溫下30~45分鐘后凝膠完全凝結,小心拔出梳子,將凝膠安放在電泳槽內;

5.        向電泳槽中倒入電泳緩沖液,其量以沒過膠面1mm為宜,如樣品孔內有氣泡,應設法除去;

6.        DNA樣品中加入10×體積的載樣緩沖液(loading buffer),混勻后,用槍將樣品混合液緩慢加入被浸沒的凝膠加樣孔內;

7.        接通電源,紅色為正極,黑色為負極,切記DNA樣品由負極往正極泳動 (靠近加樣孔的一端為負)。一般60100V電壓,電泳2040min即可;

8.        根據指示劑泳動的位置,判斷是否終止電泳;

9.        電泳完畢,關上電源,在凝膠成像儀上觀察電泳帶及其位置,并與核酸分子量標準Marker比較被擴增產物的大小。

瓊脂糖凝膠濃度與線形DNA的*佳分辨范圍

瓊脂糖凝膠濃度

線形DNA的*佳分辨范圍(bp

0.5%

1,00030,000

0.7%

80012,000

1.0%

50010,000

1.2%

4007,000

1.5%

2003,000

2.0%

502,000

膠回收純化DNA

1.      瓊脂糖電泳,將特異電泳帶用刀切下放入到EP管中,稱瓊脂糖帶的重量;

2.      按照每100mg400µl的量加入binding buffer,放入到EP管振蕩器中,45℃55℃溫育振蕩,直到所有的瓊脂糖都溶解(大概要5分鐘);

3.      取出純化柱,將上述溶解液轉移至柱中,室溫下放置2分鐘,8,000rpm 離心1分鐘,棄EP管中的液體,將純化柱放回EP管中;

4.      500µlwash buffer至柱中,8,000rpm 離心1分鐘。棄管中的溶液;

5.      重復操作4步的操作1次,*后將純化柱放入EP管中10,000rpm離心30秒,除去痕量的wash buffer

6.      將純化柱放入一個新的EP管。加30~40µl H2O或者elution buffer至純化柱膜的中央,在37℃50℃下放置2分鐘,10,000rpm離心1分鐘洗脫DNA,將EP管中的DNA溶液放在-20℃保存。

7.      注:若想要不電泳而直接純化DNA溶液,只需要在第2步中按100µl液量加400µlbinding buffer,其余的步驟不變。

大腸桿菌質粒DNA的提取(堿裂解法)

此方法適用于小量質粒DNA的提取提取的質粒DNA可直接用于酶切PCR擴增。

1.      1.5ml**培養物于EP管中,4000rpm離心1分鐘,棄上清液,使**沉淀盡量干燥;

2.      將**沉淀重懸于用冰預冷的100 µl溶液I (50 mmol/L葡萄糖,10 mmol/L EDTA pH 8.025 mmol/L Tris-HCl pH 8.0) 中,劇烈振蕩;

3.      加入200 µl新配制的溶液II(0.2 mol/L NaOH1SDSm/v),蓋緊EP管口,快速顛倒離心管5次,以混合混合物,確保離心管的整個內表面與溶液II接觸,不要渦旋,置于冰浴中;

4.      加入150 µl預冷溶液III(100 ml 的溶液III中含60 ml 5 mol/L 乙酸鉀,11.5 ml冰乙酸,28.5 ml H2O),蓋緊EP管口,反復顛倒數次,使溶液III在粘稠的**裂解物中分散均勻,之后將管置于冰上3~5分鐘;

5.      在*大轉速下離心5min,取上清液于另一新EP管;

6.      用兩倍體積的乙醇室溫沉淀雙鏈DNA,振蕩混合于室溫放置2分鐘,*大轉速離心5分鐘;

7.      小心吸去上清液,將離心管倒置于濾紙上,以使所有液體都流出,在將附于管壁的液滴除盡;

8.      1ml 70%乙醇洗滌沉淀,振蕩混合,用12,000g離心2分鐘,棄上清,將開口的EP管置于室溫使乙醇揮發,直至EP管中內沒有可見的液體存在(510分鐘),用適量的ddH2O溶解;

9.      0.5µlRNase 37℃溫育5~10分鐘;

10.  電泳鑒定。

乙醇沉淀DNA

1.        加入1/10體積的乙酸鈉(3 mol∕LPH=5.2)于DNA溶液中充分混勻,使其*終濃度為0.3 mol∕L

2.        加入2倍體積用冰預冷的乙醇混合后再次充分混勻置于-20℃15~30分鐘;

3.        12,000 g離心10分鐘,小心移出上清液,吸去管壁上所有的液滴;

4.        加入1/2離心管容量的70%乙醇,12000g離心2分鐘,小心移出上清液,吸去管壁上所有的液滴;

5.        于室溫下將開蓋的EP管的置于實驗桌上以使殘留的液體揮發至干;

6.        加適量的ddH2O溶解DNA沉淀。

 

1.      酶切前確定待切樣品的濃度, 并選擇合適的限制性內切酶和配套Buffer

2.      在離心管中加入如下成分:

10×Buffer  1μl

待切樣品  xμl

        0.5-1μl 

加水補足10μl

3.      混勻樣品并短暫離心使樣品沉于管底。

4.      將離心管置于37℃中溫育1-3hr,若待切樣品為PCR產物,則可將反應時間適當延長。

5.      用未酶切的質粒作為對照,瓊脂糖電泳鑒定酶切結果。

注:當酶切樣品用于回收而不是鑒定時,可按比例適當加大反應體積。雙酶切可選用二者活性都較高的Buffer或者通用Buffer,但要注意不能有星反應。)

1.      連接前先電泳確定待連接載體與片段的濃度。

2.      在離心管中加入如下成分:

10×連接Buffer 1μl

待連接的樣品(膠回收產物或PCR產物,載體與片段的mol比為1∶3-5

連接酶0.5-1μl 

加水補足10μl

3.      混勻樣品并短暫離心使樣品全部沉于管底。

4.      將離心管置于連接酶要求的溫度孵育適當的時間(根據不同公司的酶的要求而定,一般為22℃ 1-3hr16℃連接過夜)。

連接完的樣品可直接用于轉化,也可放4℃冰箱短期保存。

感受態細胞的制備

1.      挑取適當菌株的E.coli 單菌落接種于2ml SOB培養液中,37℃搖床過夜。

2.      0.5-1ml過夜培養的菌液轉種到50ml SOB中,18℃劇烈震蕩,直到A600達到0.6

3.      將培養物轉移到50ml離心管中,4℃ 4,000rpm/min離心10min。同時在冰浴上配置TB溶液。

4.      棄上清,將離心管倒置于濾紙上,使培養液被吸干。

5.      1ml剛配的TB溶液打散菌體沉淀,再加入15ml TB1/3體積的起始培養液),冰浴10-15min4℃ 4,000rpm/min離心10min

6.      棄上清,沉淀重懸于4ml TB1/12.5體積的起始培養液),冰浴10min

7.      加入280μl  DMSO,緩緩滴入并輕輕搖晃,使其充分混合均勻,冰浴10min

8.      將菌液分裝于EP管中,-80℃或液氮凍存。

9.      取兩管感受態細胞分別加入1μl無菌ddH2O(陰性對照)和1μl純質粒(陽性對照)進行轉化(見后),以檢測感受態的質量。陰性對照平板上應該無菌落生長,陽性對照平板上菌落數目的多少顯示感受態效率的高低。

SOB的配制:

蛋白胨        20g

酵母提取物    5g

NaCl          0.58g

KCl           0.186g

100×Mg++溶液 10ml

溶解并加水定容至1L121℃×20min高壓蒸汽**

100×Mg++溶液:  

MgCl26H2O

MgSO47H2O

溶解并加水定容至100ml121℃×20min高壓蒸汽**

TB溶液的配制:

   1M  KCl                       5ml

0.55M MnCl2                    2ml

0.5M  CaCl2                    0.6ml

0.1M K-Pipes(pH 6.7)             2ml

ddH2O                         10.4ml

Total                         20ml

上述溶液均需高壓蒸汽**處理

0.1M K-Pipes(pH=6.7)的配制

     稱取3.02g Pipes粉末溶于80ml dd H2O此時粉末不能完全溶解10N KOHKOH固體調節PH只有當PH接近6.7時粉末才能完全溶解此時當小心少量地加入KOH直至達到所需PH值。

1.      100μl感受態細胞于冰浴上融化。

2.      加入1μl純質粒或連接產物,輕輕吹打混勻,冰浴30 min

3.      將菌液放入42℃水浴中熱激90秒,立即放入冰浴中2 min

4.      加入0.9ml SOC,于37℃恒溫搖床上200rpm×1hr溫育。

5.      將菌液4000rpm/min離心3min,留200μl上清將菌體打散,均勻涂布于含適當***的瓊脂平板表面,平板37℃倒置培養過夜。

                        i.              注:新倒的平板可于37℃培養箱中預先放置數小時至過夜干燥。

     ii.   當轉化的是TA克隆連接產物時可在菌液中加入8μl 1M IPTG40μl  20mg/ml X-gal以進行藍白斑篩選。

重組子的篩選和鑒定

重組子可通過酶切進行鑒定,也可以利用擴增引物通過PCR進行鑒定,陽性重組子能切出所需要的片段或得到相應片段的PCR產物。

1.      用牙簽挑取平板上的菌落接種于2ml含適當***的LB培養基中,37℃搖床培養過夜。

2.      次日取菌液0.2-0.5ml13,000rpm×3min離心,棄上清,加入20μl  ddH2O20μl /氯仿,震蕩混勻,13,000rpm×5min離心。

3.      取上清進行瓊脂糖電泳,加入載體質粒DNA作為陰性對照,根據質粒大小初步篩選重組子,重組子的泳動速度應該慢于載體質粒。

4.      用堿法小量制備可能是重組子的質粒DNA

5.      選取適當的酶,對重組子進行酶切分析,酶切體積均為10μl。酶切樣品進行瓊脂糖電泳鑒定是否有所需片段。

6.      酶切分析正確的重組子分成兩份,一份進行測序反應,另外一份保種。

7.      若用PCR法鑒定,則在第2步時每個樣本取0.5-1.0μl 菌液為模板進行PCR反應,每管反應體系*低可少至10μlPCR產物電泳,能得到所需條帶的樣本進一步提取質粒酶切鑒定或送樣品測序。

真核細胞的轉染

該操作以Invitrogen公司的脂質體轉染試劑LipofectAMINE  為例,其它轉染試劑可參照各自的使用說明書進行。

1.      6孔板中接種1-3×105細胞/孔,加入2ml完全培養基,置CO2孵箱中37℃培養過夜。

2.      待細胞長到50-80%單層時,在無菌離心管中配制如下溶液:

                        i.              溶液A:將1-2μg待轉染的超純DNA稀釋到100μl無血清培養基中

                      ii.              溶液B:將2-25μl  LipofectAMINE稀釋到100μl無血清培養基中

3.      混合溶液AB,輕輕混勻,室溫放置15-45min

4.      2ml無血清培養基輕輕洗滌細胞,加入0.8ml無血清培養基/孔,將脂質體復合物滴加到孔中,輕輕搖晃混勻,置CO2孵箱中37℃孵育2-24hr

5.      用完全培養基替換轉染液,繼續培養。

6.      24-72hr后檢測蛋白質的表達或傳代并加入選擇性***以篩選穩定表達株。

轉染細胞的穩定篩選

1.確定***作用的*佳濃度:

不同的細胞株對各種***有不同的敏感性,因此在篩選前要做預試驗,確定***對所選擇細胞的*低作用濃度。

1)        提前24小時在96孔板或24孔板中接種細胞8孔,接種量以第二天長成25%單層為宜,置CO2孵箱中37℃培養過夜。

2)        將培養液換成含***的培養基,***濃度按梯度遞增(0, 50, 100, 200, 400, 600, 800 1000μg/ml)。

3)        培養10-14天以絕大部分細胞死亡濃度為準,一般為400-800μg/ml,篩選穩定表達克隆時可比該濃度適當提高一個級別維持時使用篩選濃度的一半.

2.轉染按前面的步驟進行。

3轉染72小時后按1:10的比例將轉染細胞在6孔板中傳代,換為含預試驗中確定的***濃度的選擇培養基。在6孔板內可見單個細胞,繼續培養可見單個細胞分裂繁殖形成單個抗性集落,此時可用兩種方法挑選單克隆。

1)      濾紙片法:用**的5x5mm濾紙片浸過胰酶,將濾紙片貼在細胞集落上10-15秒,取出粘附有細胞的濾紙片放于24孔板中繼續加壓培養。細胞在24孔板中長滿后轉入25cm2培養瓶中,長滿后再轉入75cm2培養瓶中培養。

2)      有限稀釋法:將細胞消化下來后做連續的10倍稀釋(10-2—10-10),將每一稀釋度的細胞滴加到96孔板中培養,7-10天后,選擇單個克隆生長的孔再一次進行克隆。

4. ELISAWestern blot檢測單克隆細胞中外源蛋白的表達情況由于不同克隆的表達水平存在差異因此可同時挑選多個克隆選擇表達量*高的克隆傳代并保種。                                                   

重組蛋白質的表達、純化、復性和定量

Qiagen公司的操作手冊進行,具體步驟如下。

一、重組蛋白質的誘導表達

1.      挑取轉化有質粒的單菌落,接種于3ml 選擇性LB液體培養基中,37 oC250 rpm/min振搖培養過夜。

2.      次日將培養過夜的菌液500 μl再接種于10 ml1:20)選擇性LB液體培養基中,37 oC250 rpm/min振搖培養至光密度(OD600=0.6)時,取1 ml樣本作為誘導前標本,10000g離心1 min收集菌體沉淀,-20 oC凍存備用。

3.      加入1 mol/L IPTG于菌液中,使IPTG終濃度為1 mM37 oC250 rpm/min振搖培養45小時。取1 ml樣本作為誘導后標本,同上法收集菌體沉淀,-20 oC凍存備用。

4.      將誘導前后菌體沉淀用20 ~ 40 μl PBSpH= 8.0)重懸,加入等體積的2×SDS上樣緩沖液,煮沸加熱5 minSDS聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離,考馬斯亮藍染色3小時后,脫色觀察結果。

5.      選取誘導成功的**克隆,擴大誘導規模,收集菌體沉淀,于-20 oC保存,準備做下一步分析及純化。

二、重組蛋白質的分離純化

重組蛋白質的可溶性鑒定

1.      將按上法誘導培養后收集的菌體重懸于裂解液1 (Lysis buffer under native conditions )中,然后在-80 oC低溫冰箱中放置10 min

2.      冰中解凍。

3.      在冰浴上用超聲破碎儀破菌6次,每次10 sec,間歇10 sec,電壓200-300 V

4.      10000g4oC,離心20 min,取上清(為溶液A),-20 oC保存;另將沉淀用同樣裂解液1溶解(為溶液B),同樣-20 oC保存,供后繼分析使用。

5.      將上述AB溶液和誘導前后的**進行SDS-PAGE電泳,考馬斯亮藍染色,比較分析重組蛋白質的溶解性。如果誘導表達的蛋白質位于A溶液中,則為可溶性蛋白;如果是在B溶液中,則為非可溶蛋白。

重組蛋白質為非可溶性蛋白(變性條件下)的分離純化

1.      將菌體沉淀溶于適量裂解液2Lysis buffer under denaturing conditions)中,室溫下攪拌和吹打沉淀,避免泡沫生成。

2.      10000g4 oC,離心30 min,收集上清液。

3.      Ni-NTA Agarose充填柱子,并連接于Pharmarcia低壓液相層析系統,用5倍柱體積的裂解液2平衡Ni-NTA Agarose,調節A280值至零線。

4.      將適量上清液上樣到Ni-NTA Agarose柱子中,并用lysis buffer沖洗至A280值低于0.01

5.      分別用510倍柱體積的清洗液1 和清洗液2Wash buffer 1 and 2)清洗柱子,直至A280值低于0.01

6.      用洗脫液(Elution buffer)洗脫重組蛋白質,在A280值監測下,收集出現峰線后含有重組蛋白的所有洗脫液。

三、重組蛋白質的復性、凍干和定量

純化后的蛋白用梯度降低的尿素溶液緩慢透析,*終用0.01×PBS透析,透析后的蛋白質溶液經凍干成粉狀。以牛血清白蛋白(BSA)為標準,采用BIO-RAD公司蛋白質定量試劑(protein assay)比色測定蛋白質的含量。

腫瘤細胞體外傳代培養及保種

. 細胞復蘇與培養

將液氮或-80oC保存的腫瘤細胞于37oC 水浴, 快速溶化, 8.0ml培養基混勻已融化的腫瘤細胞懸液, 1500/, 離心3分鐘。棄上清, 再吸取8.0ml培養基質混勻細胞沉淀, 1500/, 離心3分鐘, 棄上清, 細胞沉淀用1.0ml培養基混勻, 備用。 另取一個75cm2方瓶, 加入14.0ml培養基質, 將上述制備的含腫瘤細胞懸液(1.0ml)加入此方瓶中, 37oC5%CO2孵育箱中培養。

若此腫瘤細胞懸浮生長, 大約34 天細胞基質會變黃, 5.0ml細胞懸液可傳代一個方瓶培養, 可用34個方瓶培養, 一個方瓶中呈對數生長的腫瘤細胞可達1—1.5×107 , 根據試驗所需, 可決定傳代的次數。 若此腫瘤細胞呈貼壁生長, 經過3—4, 腫瘤細胞生長至80%95% 單層時, 棄上清, 0.5mM EDTA(難消化的腫瘤細胞用0.25%胰酶1.0ml), 處理腫瘤細胞大約 3—5分鐘, 用倒置顯微鏡觀察,當90% 的腫瘤細胞變圓時, 即可用彎管吹打并將消化的細胞轉移到15ml離心管中, 1500/分下,離心3分鐘, 棄上清, 加少許培養基混勻, 可傳代375cm2方瓶擴大培養。

. 細胞凍存

    將對數生長的腫瘤細胞用175cm方瓶按上述方法收集, 1500/ 離心3分鐘,棄上清, 用保種液(10% DMSO的小牛血清)3.0ml混勻, 分別加入到2—3只保種管中, 寫上腫瘤細胞名稱, 時間, 保種者姓名, -80o C 保存, 次日將它們轉移到液氮中保存(: -80o C下可保存細胞半年至一年, 液氮可保存細胞5—10, 甚至更長的時間)。以上所有物品均需經過高溫**( 121oC, 30分鐘),培養基質則經過過濾(0.22uM)**, 所有操作均必須遵守無菌操作技術, 避免**、**、病原體、衣原體等污染。

腫瘤動物模型的建立

將對數生長的腫瘤細胞收集, 用無血清基質10.0ml, 1500/, 離心3min, 連續洗3, *后用無血清基質混勻, 用血球計數器計算腫瘤細胞數量(平均5個中方格的細胞計數×104 即是腫瘤數/毫升) 計算完腫瘤細胞總數, 再將腫瘤細胞密度調至4×106 /ml, 每只小鼠腋下接種50ul(2×105個腫瘤細胞), 2周左右可捫及腫瘤小節結。一般選取6—8周的小鼠,不同的腫瘤細胞接種的數量和動物不一樣, 比如LL/2, B16, Hepa 可接種C57BALB/C 小鼠, NS-1, EL-4, C26, Meth A可接種BALB/C 小鼠, H22接種昆明鼠。從腫瘤接種后可捫及小結節開始, 3天用游標卡尺量腫瘤縱橫大小(單位: mm), 至少連續一個月時間。注意要設計不同的實驗組和對照組, 每組動物數一般為5—10, 一般接種腫瘤6—8周后,小鼠的腫瘤可生長至直徑為15—20mm (即小鼠會瀕臨死亡), 可眼球取血,分離血清并保存血清, 處死小鼠, 取腫瘤組織照相, 取部分腫瘤組織作冰凍組織切片(-80 保存), 作相應的**組織化學染色, 取部分腫瘤組織用3%中性的甲醛固定, 石臘包埋, 作常規HE染色.

小鼠尾靜脈注射方法

在靠近實驗臺邊緣處, 用大培養皿扣住小鼠, 左手抓住小鼠尾巴, 用酒精棉球擦尾巴, 可見到兩側靜脈; 注射前應確認針管內無氣泡, 注射時由尾尖開始, 順向刺入。失敗后再逐漸移向根部重刺, 若準確刺入靜脈內, 推進時無阻力, 一般可注入0.1—0.5ml

腫瘤蛋白疫苗預防性動物實驗

    一般腫瘤蛋白疫苗首次**劑量10ug/只小鼠, 與相應佐劑混勻, 在背部皮下注射, 2次**間隔2, 同樣加佐劑在皮下注射; 3次**間隔2, 同樣加佐劑在皮下注射;第3次**后2, ELISA檢測其血清效價,當效價達到要求時;在接種腫瘤細胞前3,于腹腔或尾靜脈加強注射20ug /只。

人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)培養

1.      15-20cm長的新生兒臍帶放入無菌的PBS溶液中儲存。

(注:4下*多貯存24小時,室溫下不超過6小時,否則廢棄)

2.      用一個鈍頭的針頭扎入臍帶靜脈管中,用無菌的PBS溶液沖洗3-5次,將污血沖洗干凈為止。

3.      用手術鉗夾緊臍帶下端,加入15ml 的膠原酶(1mg/ml)室溫下消化15-20分鐘,并不時上下搖動臍帶。

4.      消化完后,將下端手術鉗松開,消化液流入一個50 ml無菌離心管中,用無菌的PBS溶液沖洗臍帶2-3次。

5.      將收集液離心(2000/分)3分鐘。

6.      倒去上清,加入10ml M199培養基(加入10U/mlbFGF),用彎管吹散細胞,將所有液體轉入一個用明膠包被好的培養瓶中,37℃培養。

注:每個培養瓶中加入3-4ml無菌的1%的明膠溶液,搖勻使得明膠溶液完全鋪滿瓶底,放入37℃孵育,*少2小時,用前將明膠溶液倒了即可,明膠包被有利于細胞貼壁。

7.      培養24小時后,倒掉培養基,并用無菌的PBS溶液清洗2-3次,洗掉紅細胞和死細胞,加入10 ml新鮮的 M199培養基。

8.      以后每2天換一次培養基(每次換掉2/3的培養基)。

9.      一般培養5-7天,細胞可長滿至80-90%單層,這時可以傳代。

10.  倒掉培養基,用無菌的PBS溶液清洗2-3次,加入2-3ml消化液(0.25%胰酶+0.1%EDTA)消化細胞,在顯微鏡下觀察,一旦細胞變圓,即加入2-3倍的有血清的DMEM培養基終止反應。

11.  用彎管將細胞吹打下來,并將所消化的細胞轉移到一個50 ml無菌離心管中,2000/分,離心3分鐘。

12.  倒掉上清,加入10ml新鮮培基,一般一瓶細胞可傳代3-4.以后照此傳代培養.

13.  一般傳代2-3代(培養了20天左右)用于做各種實驗效果*好。

實驗動物**方案

1、抗原: 蛋白質、多肽、細胞器、細胞、組織等。

2、**方式:皮下注射、腹腔注射、靜脈注射、肌肉注射等

3、不同動物**所需抗原量(以蛋白**為例)

>18-20kDa                  <18-20kDa

動物     抗原量    *佳抗原量     抗原量    *佳抗原量

兔子     20-200        100         50-400       200

小鼠     2-40          15           4-60         40

大鼠     10-50         30          20-150        50

綿羊    100-1000       200         200-1000      400

母雞     20-200        100          50-400       200

單位:微克

4、**方案(以**兔子為例):

天數    0       14       28       38      56      66        87

注射    x        x        x                x

采血   2ml                        2ml           2+20ml     2+50-70ml

5、注意:

²  **次**用完全佐劑與**原混合,以后加強**用不完全佐劑與**原混合,采取多點,時間間隔式**法。

²  如果用細胞**兔子,那么每次**所需細胞量為2-3 x 107 cells

²  在連續**完三次后,需要少量取血進行ELISA檢測,檢測所**動物的抗體滴度,一般滴度能達到1:10,000-50,000。在處死所**的動物前一周應加強一次**。

²  如果用小鼠**,可以尾靜脈小量采血(大約50µl),*后取眼球大量采血(大約500-1000µl);如果用兔子**,可以耳緣靜脈小量取血(大約2mL),*后心臟大量取血(50-100mL)

²  按血清制備的標準方法將血清分離,并且分裝成小份,儲藏在-80oC

血清制備

1.        取血后,37oC下,讓血液凝固12小時(不加抗凝劑)

2.        4oC冰箱過夜(讓血塊固縮);

3.        當血清自然析出后, 4oC3000/分,離心10分鐘,分離血清,棄去不溶物;

4.        將血清移至一干凈試管,并分裝成小份,儲藏在-80oC

ELISA

一、包被抗原

1.      50mM的碳酸鹽包被緩沖液(pH 9.6)溶解抗原,使抗原濃度為10-20 μg/ml,加100 μl/孔到96孔酶標板,4 oC放置過夜。

2.      第二天棄去包被液后,用PBST洗滌3次,每孔加入150 μl 1 BSA 37 oC封閉1小時。

3.      PBST洗滌3次后,每孔加入100 μl不同倍比稀釋度的血清,并加入對照樣品,37 oC孵育2小時。

4.      PBST洗滌5次后,加入100μl稀釋后的HRP標記的二抗,37 oC孵育1小時。

5.      PBST洗滌5次后,顯色劑顯色20 min后,酶標儀上讀取A405吸收值。

二、包被細胞

1.      96孔培養板上接種細胞數為1 x 104 cells/well37℃過夜培養。

2.      第二天用PBS洗滌培養板2-3次。

3.      加入125 µl/well 10% Formalin1:10稀釋), 室溫下固定15 min

4.      ddH2O洗滌培養板3次,并晾干,儲藏在2-8oC備用。

5.      PBST洗滌3次,每孔加入150 μl 1 BSA 37 oC封閉1小時。

6.      PBST洗滌3次后,每孔加入100 μl不同倍比稀釋度的血清,并加入對照樣品,37 oC孵育2小時。

7.      PBST洗滌5次后,加入100 μl稀釋后的HRP標記的二抗,37 oC孵育1小時。

8.      PBST洗滌5次后,顯色劑顯色20 min后,酶標儀上讀取A405吸收值。

*  50mM的碳酸鹽包被緩沖液:0.05mol/L pH9.6碳酸緩沖液,4℃,保存, Na2CO3 0.15, NaHCO3 0.293,蒸餾水稀釋至100 ml

*  ABTS作為底物進行顯色反應(10ml)

²  0.2M  Na2HPO4  2.4ml

²  0.1M  檸檬酸2.6ml

²  ddH2O   5ml

²  ABTS  5mg

²  H2O2(30%)  4 ul(用前加入)

意:

²  一般做倍比稀釋進行檢測,需要有相應的對照血清。

²  不同的顯色系統對應不同的光吸收值。

血清學篩選克隆新抗原/新基因

一、E.coli/ phage 裂解液預吸附血清

1.        E.coli /phage lysate1:10-20稀釋在TBST溶液中。

2.        482mmnitrocellulose membranesNC)浸入稀釋后的E.coli/ phage lysate中,室溫下水平搖動30分鐘,取出NC并使膜瀝干。

3.        50ml TBST溶液洗膜3次,每次10分鐘。

4.        用濾紙輕輕吸去膜上的液體。

5.        將膜放入50ml封閉液中,室溫下水平搖動*少30分鐘。

6.        將膜從封閉液中取出,用50ml TBST溶液洗膜3次,每次10分鐘。

7.        將血清按1:5稀釋在TBST溶液中,將一張膜放入溶液中,37℃下輕輕水平搖動10分鐘。

8.        從血清稀釋液中取出膜并丟棄,加入另外一張新膜,37℃下輕水平搖10分鐘.

9.        重復步驟8,直至所有4張膜都處理完。

10.    除去*后一張膜,收集血清(primary antibody),分裝成小份儲存于-80℃冰箱中待用。

注意:

²  該步處理過程是為了去除血清中能與**和噬菌體裂解蛋白進行**反應的抗體,這樣可以減少假陽性率;

²  一抗不能反復凍融,化凍后不要再次冰凍,可放于4℃作短暫保存;

²  可以是病人血清,也可以是**血清,如果是病人血清,則需要至少10個病人血清進行混合;

二、噬菌體篩選

1.        準備NZY agar plates(至少用前24小時倒好),用前在37℃培養箱中烘烤1-2小時以去除水滴。

2.        將過夜培養的XL1-blue MRF’**2000/分,離心10分鐘,將**溶解在10mM MgSO4中,調整**濃度為OD600=0.5

3.        融化NZY top,并將NZY top放在50℃水浴中。

4.        將適量的XL1-blue MRF’**溶液與一定稀釋度的phage文庫混合,37℃下共同作用15分鐘。

²  直徑90mm平板:200µl XL1-blue **+適量的phage文庫

²  直徑150mm平板:600µl XL1-blue **+適量的phag文庫

(噬菌斑數量一般保持在3000pfu/90mm; 12000pfu/150mm

5.        將步驟4中的混合液與NZY top溶液混合(200µl混合液+3-4mlNZY top溶液;600µl混合液+8-10 ml NZY top溶液),倒入到NZY agar plates中,室溫下放10分鐘左右,然后倒置放于37℃下培養。

6.        當噬菌斑剛好可看到時(大約5-8小時),從培養箱中拿出平板。

7.        NC放入10mM IPTG溶液中完全浸濕,在空中使膜瀝干,并做好3個不對稱的標記。

8.        IPTG處理好的NC貼在平板上,不留氣泡,然后倒置放于37℃下培養。

9.        過夜培養后,第二天早上取出平板,用鑷子將膜輕輕掀起,注意不要將培養基粘在膜上。

10.    將膜放于50ml TBST溶液中,水平脫色搖床上震蕩洗膜3次,每次10分鐘。

11.    將膜放入50ml封閉液中,水平搖動,封閉4-6小時。

12.    在封閉液中加入適當滴度的一抗,水平搖動處理過夜。

13.    將膜放于50ml TBST溶液中,洗膜3次,每次10分鐘。

14.    在封閉液中加入適當滴度的二抗(各個公司的二抗使用滴度不同),室溫水平搖動1-2小時。

15.    將膜放于50ml TBST溶液中,洗膜3次,每次10分鐘,*后用50ml TBS溶液洗膜15-20分鐘,取出膜空氣中瀝干。

16.    將膜放入BCIP-NBT顯色液中避光顯色,水平搖動直到陽性斑點可見為止。

17.    從顯色液中取出膜放在TBS溶液中,空氣中使膜干燥。

18.    根據所做的標記,將膜與平板對齊,將平板上對應的陽性克隆區域的培養基挖出放入500µl SM buffer,并加入25 ml chloroform,4℃貯存(*多可貯6月)。

19.    **輪篩選得到陽性克隆需要進行第二輪篩選以去除假陽性并獲得陽性單克隆噬菌體。過程如**輪篩選,只不過用直徑90mm平板;具體過程見步驟4,這時所加入的噬菌體溶液是**輪篩選得到的噬菌體上清(見步驟18),在用前要滴定好噬菌體的滴度,噬菌斑的數量以可區分出單個克隆,同時密度不能太稀為標準(一般100-200 pfu/90mm)。

20.    按**輪相似的過程進行實驗,*后顯色,確定真正的陽性克隆,并將陽性單克隆所在的培養基挖出放入500µl SM buffer中,并加入25 ml chloroform4℃貯存(*多可貯存6月)。

注意:

²  封閉液一般可用:5%的脫脂牛奶或1%BSA溶解在TBST溶液中。

²  **輪篩選用150mm的平板;第二輪篩選用 90mm的平板,一般需要篩選至少1 x 106 pfu

²  認真做好三個不對稱的標記,特別在第二輪挑選陽性克隆時要仔細將膜與平板吻合好,不能挑錯。

三、單克隆剪切

1.        取第二輪篩選得到的陽性克隆貯存液上清。

2.        將過夜培養的XL1-blue MRF’**2000/分離心10分鐘,將**溶解在10mM MgSO4中,調整**溶度到OD600=1.0

3.        在一個EP管中加入:200µl XL1-blue MRF’**+250ul phage stock(步驟1+1 ul ExAssist helper phage

4.        將以上三種樣品混合,37℃下共同保溫15分鐘。

5.        將樣品混合物加入到3 ml LB培養基中,37℃震蕩培養3-4小時。

6.        將試管放于65-70℃水浴20分鐘,3000/分,離心15分鐘。

7.        將上清轉入新的離心管中,已發生剪切的phage particles在上清中(上清可在4℃下儲存1-2月)。

8.        100ul phage 上清+200ul SOLR cellsOD600=1.0)混合,37℃保溫15分鐘。

9.        取步驟8中溶液5-10 ul涂于LB-amp agar platesamp=50ug/ml),過夜培養。

10.    第二天**長出,隨機挑取單克隆接種到LB-amp培養基中培養過夜。

11.    過夜培養**分為三部分:(1)提取質粒做雙酶切,鑒定外源基因的大小;(2)送樣品進行DNA測序(3)加入30-40%的甘油進行保種,分裝成小份儲存于-80℃備用。

附錄:

1SM buffer (1L):

(5.8 g NaCl+2.0 g magnesium sulfate+50 ml 1M Tris (pH=7,5)+0.1 g gelatin)
2
AP-buffer:

(100 mM Tris HCI (pH 9.5) ;  100 mM NaCl ;  5 mM MgCl2)

310xTBS1L):

0.1 M Tris-HCl (pH 8.0)1.5 M NaCl

4LB Broth1L):

10 g NaCl+10 g of tryptone+5 g of yeast extract

ELISPOT

1.      PBS溶解抗原為30 μg/ml,加100 μl/孔于PVDF膜鋪底的96孔**板過夜;

2.      第二天吸去包被液后,加5FCSPRMI 1640培養基100 μl封閉1小時,37 oC

3.      準備脾細胞懸液(用氯化銨去除紅細胞,制備成單個脾**細胞懸液);

4.      1 × 106/孔開始,按1:3的稀釋度開始逐孔稀釋做不同濃度梯度,并做3個復孔,37 oC靜置培養5小時;

5.      PBS35次,生物素化的抗鼠IgG二抗孵育30 min

6.      PBS35次,鏈親和素標記的堿性磷酸酶孵育30 min

7.      PBS35次,用底物BCIP/NBT顯色,顯微鏡下觀察顯色反應,顯色后及時終止反應;

8.      計數每孔中的斑點數目,計算每106個脾細胞中抗體分泌細胞數量。

藻酸鹽包裹實驗

1.      將藻酸鈉溶于無菌生理鹽水,終濃度為1.5%

2.      收集培養的腫瘤細胞,用無血清的培養基洗滌1次,將細胞沉淀重懸于1.5%藻酸鈉溶液中;

3.      將上述腫瘤細胞懸浮液用1 ml加樣槍緩慢滴入磁力攪拌的250 mM CaCl2溶液中,形成乳白色的藻酸鹽小珠。繼續靜置于250 mM CaCl230 min即可使用。以上操作步驟均在無菌條件下進行;

4.      將第4次**后7天的小鼠用****鈉0.1ml (100 mg/kg) 腹腔注射麻醉,小鼠麻醉后置于解剖臺上,切開背部皮膚,皮下植入4粒藻酸鹽包裹顆粒,縫合皮膚,外敷手術膠膜;

5.      天以后,小鼠經尾靜脈注入100 μl (100 mg/kg) FITC標記的葡聚糖(FITC-Dextran)

6.      20 min后處死動物,取出藻酸鹽顆粒,常溫下加入1 ml的生理鹽水,剪碎研磨顆粒,再加入1 ml的生理鹽水,混勻標本,放置1小時,1500 rpm離心5 min。取上清液用熒光酶標儀測定;

7.      用不同濃度的FITC-Dextran制備標準曲線。

重組腺病毒構建,擴增及純化基本技術操作

(**內同源重組AdEasy System

 

目的基因的克隆(以pshuttle-CMV質粒為例)

1.      選擇適當酶切位點,進行酶切連接,將目的片段插入pshuttl-CMV質粒多克隆位點。

2.      重組質粒鑒定: 酶切鑒定或測序。

3.      重組質粒擴增,純化并準備適量含目的基因的穿梭質粒。

4.      PmeI單酶切線性化重組穿梭質粒,電泳鑒定質粒完全被切開。

5.      膠回收線性化質粒,以備共轉化使用。

共轉化

大腸桿菌BJ5183電轉感受態制備

²  從新鮮瓊脂板上挑取單個BJ5183**,接種于LB培養基中,37℃振搖過夜。

²  接種25ml過夜培養物于500ml LB培養基,37℃振搖,至OD600 達到0.4

²  迅速將培養物置于冰浴中30min,至充分冷卻。

²  將菌液轉移至預冷的離心管中,4℃下以2500r/min離心15 min,棄培養液,回收細胞。

²  10ml預冷的10%甘油洗滌沉淀,低溫離心,共兩次。

²  加約1ml(適量)預冷的10%甘油重懸沉淀,稀釋懸液100倍,測量OD600至稀釋濃度為2-3×1010個細胞/ ml (1.0 OD6002.5×1010個細胞/ml)。分裝,-80℃或液氮保存待用。

病毒骨架質粒轉化大腸桿菌,擴增,純化。

1-5µl (1µg) 線性化的穿梭質粒及1µl(約100ng/µl)病毒骨架質粒(如pAdEasy-1)加入至含約40µl BJ5183電轉感受態的EP管中混勻,冰上冷卻。

將混合物加入電轉杯,電擊(1250-1500V/mm,5ms)。

電擊結束取出樣品,加入1ml SOCLB培養液,37℃低速振蕩40min

取適當體積的電擊轉化細胞液涂于數個卡那霉素抗性平板(25-50mg/ml),37℃培養16-20hr

次日挑取平板上長出的菌落(選擇*小的菌落),接種于3ml25-50mg/mlLB培養基,37℃培養10-15hr

堿裂法提取質粒,0.8%瓊脂糖凝膠電泳篩選,大質粒為可能陽性克隆,進一步酶切鑒定。以PacI單酶切,0.8%瓊脂糖凝膠電泳如顯示出一條大片段(約30kb,及一條小片段(約3.04.5kb)(同時可進行其它酶切鑒定),則基本確定為陽性克隆。

1-5µl 陽性質粒轉化至DH5α大腸桿菌細胞(BJ5183recA+,質粒DNA易發生突變,DH5αJM109XL1-blue菌株為重組缺陷性菌株,可穩定擴增已鑒定的重組質粒),擴增**并純化質粒。

重組病毒質粒轉導293細胞

1  293細胞培養:轉導24小時前,以方瓶為例,接種2×10293細胞于25cm2方瓶,使生長密度約50-70%。(也可以使用6孔或96孔板)

PacI單酶切重組病毒質粒(轉導25cm2方瓶約需4µgDNA),完全線性化后,乙醇沉淀,再以20 µl ddH2O溶解。

脂質體包裹質粒(以Lipofectamine為例):4µg PacI約需20µl Lipofectamine包裹.質粒及脂質體分別稀釋于500µl無血清培養基再混合,置于室溫下15-30min

以無血清培養基輕輕洗滌培養瓶,另加2.5ml無血清培養基,37℃放置10min

Lipofectamine-DNA混合物加入培養瓶,37℃孵箱放置4hr

6  4hr后,棄Lipofectamine-DNA混合液,另加入6ml DMEM完全培養基(含10% FCS)。如有大量細胞漂浮,可不棄Lipofectamine-DNA液,加入6ml DMEM完全培養基,37℃孵育過夜,再換液。

培養過程中觀察細胞生長情況。約2周后可觀察到細胞病變(CPE)出現(如用pAdTrack-CMV質粒,由于含GFP,可觀察到綠色熒光)。

重組病毒鑒定

轉導10-14d后,收集細胞沉淀,加入2ml**的PBS混懸,凍融細胞,離心后收集上清保存于-80℃

30-50% 步驟1中上清,感染50-70%飽和度的25cm2方瓶中293細胞。2-3d后出現明顯細胞病變。

感染后3-5d,1/3-1/2細胞漂浮時收集病毒。按步驟1收集細胞并準備病毒上清。通過Western blot/PCR鑒定重組腺病毒產生。

4  PCR鑒定重組病毒。取5µl病毒上清加入10µl蛋白酶K55℃孵育1hr,再煮沸5min,離心后取1-2µlPCR

重組病毒擴增,純化

1  75cm2方瓶中接種293細胞,至密度達到90%,加入適量病毒上清感染細胞。3-4d后,細胞幾乎變圓,且有一半細胞漂浮,則收集所有細胞。約500g轉速離心,棄上清。

以**PBS重懸沉淀,反復凍融4次。4℃7000g離心5min.病毒純化至少需要3075cm2方瓶細胞。

3  CsCl連續梯度離心純化:50ml離心管中稱量4.4g CsCl,加入8ml病毒裂解上清液,混勻,體積約為10ml。轉移至12ml超速離心管(用于SW41轉頭)中,覆蓋約2ml礦物油。平衡后,10℃32000 rpm離心18-24hr,用注射器抽吸離心出的病毒帶。

(也可CsCl不連續梯度離心:20ml超速離心管中緩慢加入8ml CsCl 1.4 (53 g + 87 mL 10 mM Tris-HClpH=7.9),上面小心加入6 mL CsCl 1.2 (26.8 g + 92 mL 10 mM Tris-HClpH=7.9),再小心加入病毒上清液至體積達到20ml。平衡后,4℃ 23000rpm離心90min (SW28轉頭),用注射器抽吸下層藍白色病毒帶)

病毒透析去鹽:配置透析液(10 mM Tris pH 8.0, 2 mM MgCl2, 5% sucrose),**處理。4透析,更換3次透析液,可基本去除CsCl,病毒保存于-80℃

病毒滴度測定(TCID50

細胞準備:96孔板中接種100µl 293細胞,每孔細胞數約104,2% DMEM培養

稀釋病毒液準備:以2% DMEM將病毒液稀釋成8個較高濃度(如10-3-10-10),每個濃度重復10個,每孔加入病毒稀釋液100µl。另留兩排不加病毒液作為陰性對照。37℃下,孵箱培養10天。

3  10d后觀察細胞,記數每排出現CPE的孔數,計算細胞病變率。(如某一濃度各孔細胞全部病變,比率為1,如無細胞病變,則比率為0)。

計算T =10×101 + d (S - 0.5) /ml

d = Log 10 稀釋度(如為10倍稀釋d=1

   S = 各濃細胞病變比率之和

實驗室重組腺病毒常用質粒:病毒骨架質粒:pAdEasy-1, pAdEasy-2

穿梭質粒:p-Shuttle, p-Shuttle-CMV, pAdTrack, pAdTrack-CMV

 

組織病理技術

組織處理:

1.        取新鮮組織厚度不超過5mm10% 中性福爾馬林固定,大于24小時。

2.        固定后沖水12-24小時,

3.        75%酒精,   1次,1小時,

4.        85%酒精,   1次,1小時,

5.        95%酒精,   3次,1小時,

6.        100%酒精,  3次,1小時,

7.        二甲苯,     2次,1小時,

8.        石蠟浸泡,   3次,2小時,

HE 染色:

   {水化}

1.        二甲苯,     2次,5-10分鐘,

2.        100%酒精,  1次,1-2  分鐘,

3.        95%酒精,   1次,1-2  分鐘,

4.        85%酒精,   1次,1-2  分鐘,

5.        75%酒精,   1次,1-2  分鐘,

6.        過蒸餾水,

   {染色}

1.        Mayer 氏蘇木素,1   分鐘,

2.        溫水沖洗,      5-10 分鐘,

3.        75% 鹽酸酒精, 1-2  分鐘,

4.        自來水沖洗,    30  秒鐘,

5.        依紅復染,      1-2  分鐘,

6.        自來水洗,      30  秒鐘,

7.        85%酒精,      1次,1-2  分鐘,

8.        95%酒精,      2次,1-2  分鐘,

9.        100%酒精,     2次,1-2  分鐘,

10.    二甲苯,       2次,5-10分鐘,

11.    中性樹膠封片。

**組化染色

一.石蠟切片**組化染色實驗步驟:

  1.石蠟切片脫蠟至水:(石蠟切片染色前應置60℃ 1小時)。

   1)二甲苯III,10分鐘。

   2)梯度酒精:100%2分鐘® 95%2分鐘® 80%2分鐘® 70%2分鐘。

   3)蒸餾水洗:5分鐘,2次(置于搖床)。

  2.過氧化氫封閉內源性過氧化物酶:3%H2O2,室溫10分鐘(避光)。

  3.蒸餾水洗:5分鐘,2次(置于搖床)。

  4.抗原修復:根據待檢測的抗原,選擇適當的方法。

附:抗原修復液(10mM pH 6.0枸櫞酸鈉緩沖液)的配制

    1)儲備液的配制:  

           A液:枸櫞酸三鈉-2H2O 29.41g + 蒸餾水1000ml              

           B液:枸櫞酸 21g + 蒸餾水1000ml                  

       2)工作液的配制:A82ml + B18ml + 蒸餾水900ml

      抗原修復的方法:

(1)高壓鍋處理技術:枸櫞酸鈉緩沖液(10mMPH6.0,淹沒切片,                 上鍋蓋,高壓鍋內煮沸,上汽3分鐘后緩慢冷卻(可用自來水在高壓鍋外沖,以助冷卻)。

(2)微波處理技術:用塑料切片架,置于塑料或耐溫玻璃容器內,枸櫞酸鈉緩沖液淹沒切片,選擇中高或上等,5分鐘;取出并補充已預熱的枸櫞酸鈉緩沖液;再選擇中高或上等,5分鐘.(*佳溫度為92~95℃

   3)酶消化處理:此略。

  抗原修復的注意事項

   1)組織不能干。

   2)選擇抗原修復方法要因抗體而異。

   3)該方法主要用于10%福爾馬林固定、石蠟包埋組織。

   4)抗原修復后至DAB顯色的過程中,均需用PBS緩沖液。

   5PBS5分鐘,2次(置于搖床)。 

   6.正常血清封閉:從染片缸中取出切片,擦凈切片背面水分及切片正面組織

      周圍的水分(保持組織呈濕潤狀態),滴加正常山羊或兔血清(與第二抗   同源動物血清)處理,37℃15分鐘。

   附:正常血清配制 (或按試劑盒規定的濃度配制)

   1:20比例,PBS配制,每張切片需要量按50ml+5ml (10%拋灑量)計算。

   7.滴加**抗體:用濾紙吸去血清,不洗,直接滴加**抗體,37℃ 2小時

     (也可置于4℃冰箱過夜)。

   8PBS5分鐘,2次(置于搖床)。

   9.滴加生物素化的二抗,37℃40分鐘。 

   10PBS5分鐘,2次(置于搖床)。

   11.滴加三抗 SAB復合物),37℃40分鐘。  

   12PBS5分鐘,2次(置于搖床)。

   13DAB 顯色,鏡下觀察,適時終止(自來水沖終止)。

   附:DAB的配制

(1)儲備液(DAB 25mg/ml)的配制:DAB 250mg + PBS 10ml,待完全溶解后分裝成 1ml,100ml,50ml20ml等,—20℃,凍存。

    2)工作液:DAB 儲備液20ml + PBS 1000ml + 3% H2O5ml            

   14.自來水(細水)充分沖洗。

   15.蘇木素復染,室溫,30秒,自來水沖洗。

   16.自來水沖洗返藍,15分鐘。

   17.梯度酒精脫水:

    80%2分鐘 ® 95%2分鐘 ® 100%2次,5分鐘。

   18.二甲苯透明:

    III(二甲苯)各5分鐘

   19.封片:加拿大樹膠(或中性樹膠)封片。

二.細胞爬片的**組化染色:

1.        取出細胞爬片,迅速置入冷丙酮固定20 ~30分鐘。

2.        蒸餾水浸泡5分鐘,2次。

3.        打孔液浸泡5分鐘。

4.        蒸餾水浸泡5分鐘,2次。

5.        后接前述實驗步驟的第6步(正常血清封閉)。

注:第34步僅用于檢測細胞內抗原,檢測細胞膜抗原時不用。

三.冰凍切片的**組化染色:

1.        新鮮組織立即在恒冷冰凍切片機內切片(也可-80℃保存),厚度為56mm

2.        載玻片可不打底,裱片后,立即用電吹風吹干。

3.        如不馬上染色,可密封后-20℃保存。

4.        染色前用冷丙酮在4℃固定10-20分鐘。

5.        PBS2,每次5分鐘,(必要時應用0.1%檸檬酸鈉+0.1%triton打孔)

6.        3% H2o2滅活內源性過氧化物酶,20分鐘,避光;

7.        PBS 2,每次5分鐘;

8.        接前面實驗步驟第六步.

.切片的預處理:

1.        洗衣粉液浸泡30分鐘,沖洗,晾干。

2.        洗液 (含強酸、高錳酸鉀等)浸泡24小時,沖洗,晾干。

3.        APES1:50 丙酮溶液) 10-20秒(注意:不能用塑料容器及塑料切片架)。

4.        純丙酮 I,約10秒。純丙酮 II,約5

5.        晾干或烤箱內烤干,備用。

流式細胞儀常用的幾種檢測方法

一、測定用乙醇固定的DNA的含量

1、培養細胞的DNA含量的測定

制備單細胞懸液于200μlPBS緩沖液中;

加入2ml預冷的70%乙醇,4℃保存;

 :細胞固定的一般步驟

1)        取單細胞懸液12×106個細胞于PBSPH=7.2)緩沖液中;

2)        300g離心5分鐘,棄上清,反復兩次;

3)        重懸細胞于0.5ml PBS緩沖液中;

4)        將細胞懸液放置于23ml70%乙醇中,混勻,保存于4℃,至少30分鐘。在4℃條件下可保存2~3周。

 注意:

²  根據實驗的要求,固定劑也可選用13%多聚甲醛;

²  將乙醇作為固定劑時,乙醇應預冷至04℃

²  細胞在固定時,固定劑應緩慢滴入細胞懸液中,使固定劑的濃度緩慢增加,并不斷震搖,以免細胞成團(特別是用乙醇固定時)。

²  300g離心5分鐘,去上清,再重懸于400μl PBS中;

²  顯微鏡下觀察,若有明顯的黏附,須再用篩網過濾;

²  加入PI(含Rnase),避光孵育30分鐘;

²  上機檢測。

2、新鮮組織的DNA含量的測定

1)        200mg濕重組織用機械法制成單細胞懸液;

2)        500g離心5分鐘;

3)        棄上清,重懸于10ml染色-去污劑中;

4)        再過濾,用200目的篩網或70~80μm的篩網過濾;

5)        上機檢測。

3、石蠟包埋組織切片的DNA含量的測定

1)        從石蠟包埋切取切片50 μm厚,2~3片,制成單細胞懸液;

2)        PBS緩沖液洗滌,500g離心5分鐘,棄上清;

3)        加入PI1ml室溫避光30分鐘;

4)        調整細胞濃度為1×106/ml

5)        上機檢測。

二、細胞凋亡檢測及相關分子檢測

1、細胞DNA含量分布(由細胞DNA降解方式檢測細胞凋亡)

²  收集已固定的單細胞懸液約5×105~1×106/ml

²  離心除去固定液,3ml PBS重懸細胞;

²  1500rpm離心,5分鐘 ,棄去PBS

²  PI染液1ml,室溫避光20分鐘;

²  調整細胞濃度5×105/ml

²  上機檢測。

2、磷脂酰絲氨酸外翻分析檢測細胞凋亡

1)        常規制備單細胞懸液,PBS洗兩次.(若為全血要先溶                            ),取約5×106個細胞,1500rpm離心,棄上清,400μl 1×Binding Buffer重懸;

2)        分成abcde五管,每管約1×106個細胞

a)        陰性對照,不加任何試劑;

b)        陽性對照,2%多聚甲醛固定30分鐘,AnnexinV 5μl,室溫10min,1×Binding Buffer洗一次,棄上清再加190μl 緩沖液、10μl PI避光15分鐘   

c)        10μl PI,避光孵育15分鐘;

d)       5μl AnnexinV液,室溫避光孵育15min

e)        10μl PI5μl AnnexinV液,室溫避光孵育5min

3)        每管各加400μl 1×Binding Buffer

4)        上機檢測。

注意 a. 操作動作要盡量輕柔,勿用力吹打細胞;

b. 操作時注意避光;

c. 反應完畢后盡快檢測,*好在一小時內檢測。

3、用單克隆抗體APO2.7檢測細胞凋亡

1)        放置0.5~1×106個細胞到試管中;

2)        室溫離心200g6min

3)        棄上清,加入100μl冷的(4℃)在PBSF溶液中含100µg/mldigitonnin,輕輕地重懸細胞,在冰上孵育20min

4)        加入2ml冷的(4℃PBSF液,室溫離心200g6min

5)        棄上清,加入20μl PE標記的Apo2.7 單克隆抗體和80μl PBSF液,用vortex輕輕震蕩,室溫避光孵育15分鐘;

6)        加入2ml PBSF液,室溫離心200g6min

7)        棄上清,加入1ml PBSF液重懸細胞;

8)        避光保存,直到流式細胞儀檢測。

        PBSF:含2.5% FCSv/v)和0.01%NaN3w/v)的PBS

三、用流式細胞術進行DNA周期分析

     1、方法:同DNA含量檢測

     2、注意:

單細胞濃度應約106/ml,以免影響檢測的CV值和檢測結果;

制備完成后的標本應用光學顯微鏡檢查其質量(如細胞是否聚集或過多碎片),以保證得到足夠的細胞含量;

醛類固定會影響PI與核酸的結合。

四、**熒光標記法

1、細胞膜上的**熒光檢測法

間接標記法

1)        制備單細胞懸液;

2)        細胞計數,取出1×106個細胞于試管中;

3)        用臺盼藍染色計活細胞數,要求活細胞數 >9095%

4)        在試管中加入一抗,(劑量按照說明書的要求),孵育3060分鐘;

5)        PBS洗滌12次,1500rpm,離心3分鐘,棄上清;

6)        加入二抗,孵育2030分鐘;

7)        PBS洗一次,1500rpm,離心3分鐘,棄上清;

8)        300μl PBS,上機檢測(若不能及時上機檢測,可加1ml 1%多聚甲醛固定,可放置1)

直接標記法

同間接標記法

在試管中加入熒光標記的抗體,混勻,孵育30分鐘;

PBS2次,1500rpm,離心3分鐘,棄上清;

300μl PBS(PH=7.4),上機檢測。

2 細胞膜內的**熒光標記法

間接**熒光標記法

1)        取已制備好的單細胞懸液,用13%的多聚甲醛固定30分鐘(也可4℃保存過夜);

2)        PBS洗兩次,棄上清;

3)        細胞膜打孔,加入0.1%皂素 200μl,室溫10分鐘;

4)        PBS洗滌兩次;

5)        加入**抗體,室溫3060分鐘,或4℃過夜,同時須設陰性對照或同型對照管;

6)        PBS洗滌兩次;

7)        加入二抗(熒光標記的抗體)室溫20分鐘,避光;

8)        PBS洗滌12次,棄上清;

9)        重懸細胞于500μlPBS中,上機檢測。

直接熒光標記法

同間接熒光標記法;

加入熒光素標記好的抗體,避光30分鐘(同時做同型對照管);

PBS洗滌1~2次,棄上清;

300μl PBS上機檢測。

細胞膜上及細胞內雙標記法(直標法)

1)        取出已制備好的未固定的單細胞懸液1×10 6個細胞于試管中;

2)        PBS洗滌兩次;

3)        加入用熒光素標記的抗體來標記細胞膜上的抗原,同時加上陰性對照管,室溫孵育20分鐘;

4)        在試管中加入1%~3%多聚甲醛1ml,固定30分鐘;

5)        PBS洗滌兩次1500rpm 3分鐘,棄上清;

6)        打孔,加入0.1%皂素200μl室溫10分鐘;

7)        PBS洗滌兩次,棄上清;

8)        加入用熒光素標記的抗體,標記膜內的抗原(標記膜內的抗體的熒光素的顏色與膜上標記的熒光素的顏色務必不相同)室溫20分鐘孵育;

9)        PBS洗一遍棄上清;

10)    300μlPBS重懸細胞,上機檢測

五、流式細胞術中的幾點注意事項:

1、對照組的設置:

       在流式細胞術中所測得的量都是相對值,不是優良值。如需知道優良值時必須設置對照組樣品。對照組樣品包括有陰性對照和陽性對照。

1)、陰性對照的設置

²  在實驗過程中,如做間接標記法,可設置與一抗無關的實驗,即在實驗中不加一抗而只加上帶有熒光標記的第二抗體作為陰性對照管,作為陰性對照。

²  在實驗過程中,假設做直接標記法,可設置理論上的陰性細胞作為陰性對照管,實驗過程及步驟與實驗組務必相同。(做間接標記法時,同樣也可同時設置陰性細胞的陰性對照管作為陰性對照。

²  在實驗過程中,假設做直接標記法,可將實驗組細胞,取一管,加上與實驗抗體所標記的熒光顏色相同的同型對照來作為陰性對照。

2)、陽性對照的設置:

在實驗過程中如涉及到表達缺失或減少的實驗,應設置陽性對照組,其設置方法與陰性對照設置相同。

 2、幾點建議:

1)        在實驗過程中,在保證實驗的科學性和準確性的基礎上,應盡量減少實驗工序和過程。由于間接標記法的工序多,實驗過程長,如再加之操作的不熟練,細胞更容易丟失和受損,而造成實驗結果的誤差。因此,在條件允許的范圍內,建議盡量做直接標記法而不去做間接標記法,以保證實驗的真實性和準確性。

2)        建議送檢細胞一定要足夠量,一般要求1×106個細胞。不要過少。因為,如細胞太少檢測時樣本流量相對會增大從而影響變異系數,結果也不可信。細胞量也不宜過多,因細胞量太多加入的抗體或染料相對不足,結果也由此受影響。

3)   同一種細胞需同時做雙標記時,須做雙標記的同型對照,且兩種抗體所標記的熒光顏色務必不同。

Western Blot(**印跡法)

主要包括以下4個基本步驟:

n  樣品制備

n  電泳分離

n  蛋白的膜轉移

n  **雜交與顯色――蛋白檢測

溶液和試劑

n 1X 磷酸鹽緩沖液(PBS)

n Modified RIPA buffer

Tris-HCl: 50 mM, pH 7.4 ; NP-40: 1% ;Na-deoxycholate: 0.25% ;NaCl: 150 mM ;EDTA: 1 mM ;PMSF: 1 mM ;Aprotinin, leupeptin, pepstatin: 1 microgram/ml each ;Na3VO4: 1 mM ;NaF: 1 mM

n 1X SDS 樣品緩沖液

62.5 mM Tris-HCl (pH 6.8 25°C), 2% w/v SDS, 10%甘油,50 mM DTT, 0.01% w/v溴酚藍

n 轉移緩沖液

25 mM Tris base, 0.2 M 甘氨酸, 20%甲醇 (pH 8.3)

n 10X Tris緩沖鹽 (TBS)

準備1L 10X TBS: 24.2 g Tris base, 80 g NaCl;1N HCl調pH 7.6

n 脫脂奶粉或BSA

n 甲醇

n TBS/T緩沖液

1X TBS, 0.1% Tween-20

n 封閉緩沖液(TBS/T

1X TBS, 0.1% Tween-205% w/v脫脂奶粉或BSA

n 一抗的稀釋

1X TBS, 0.1% Tween-20 5% BSA (多抗) 5%脫脂奶粉(單抗)

Note: 一般來說, BSA被推薦用于多克隆抗體,脫脂奶粉用于單克隆抗體,這樣可得到較高的信噪比。抗體的稀釋度參考抗體說明書或根據實驗確定。

n 預染的蛋白質Marker,可用于監測轉膜的效率

樣品制備

原始樣品可為細胞、組織、培養上清、**沉淀或親和純化的蛋白,以下為定性檢測目的蛋白時細胞樣品的處理方法,其余的樣品制備方法參閱相關文獻。

1.培養細胞或**處理。

2.棄培養基,用1X PBS漂洗細胞2次,去盡殘留培養基。

3.加入1X SDS樣品緩沖液(6-well plate, 100 µl /w 75 cm2 plate, 500-1000 µl/),刮落細胞,轉移到Ep管。注意:冰上操作。

4.超聲 10~15秒剪切DNA以減低樣品粘性。

5.煮沸樣品5 minutes

6.離心12000g, 5 min,取上清。

7.電泳分離:上樣15µl~20 µl SDS-PAGE (10 cm x 10 cm)電泳。
如要定量檢測某蛋白的表達水平,應用RIPA裂解液(1 ml per 107 cells/100 mm dish/150 cm2 flask)裂解細胞,收集裂解液至離心管中,在振蕩器上混勻415min14000g離心15min4℃),棄沉淀,用Bradford法或其它蛋白質測定方法測定上清中蛋白濃度以調整上樣體積和上樣量,進行Western雜交時還需設置內或外參照,通常用beta-actin

注意:一般上樣20~30 µg已足夠,如待檢蛋白為低豐度蛋白,可加大上樣量至100µg,但電泳條帶易拖尾,可制備亞細胞組份或采用更敏感的檢測方法。

電泳分離(參照SDS-PAGE電泳方法)

轉膜

雜交膜的選擇是決定Western blot成敗的重要環節。應根據雜交方案、被轉移蛋白的特性以及分子大小等因素,選擇合適材質、孔徑和規格的雜交膜。用于Western blot的膜主要有兩種:硝酸纖維素膜(NC) PVDF膜。NC膜是蛋白印跡實驗的標準固相支持物,在低離子轉移緩沖液的環境下,大多數帶負電荷的蛋白質會與膜發生疏水作用而高親和力的結合在一起,但在非離子型的去污劑作用下,結合的蛋白還可以被洗脫下來。根據被轉移的蛋白分子量大小,選擇不同孔徑的NC膜。因為隨著膜孔徑的不斷減小,膜對低分子量蛋白的結合就越牢固。通常用0.45µm0.2µm兩種規格的NC膜。大于20kD的蛋白可用0.45µm的膜,小于20kD的蛋白就要用0.2µm的膜了,如用0.45µm的膜就會發生“Blowthrough”的現象。PVDF膜靈敏度、分辨率和蛋白親和力比常規的膜要高,非常適合于低分子量蛋白的檢測。但PVDF膜在使用之前必需用純甲醇浸泡飽和1-5秒鐘。

蛋白質常用的轉移方法主要有兩種:槽式濕轉和半干轉移。前者操作容易,轉移效率高;而后者適用于大膠的蛋白轉移,所用緩沖液少。以下為槽式濕轉的操作步驟。

1.      將膠浸于轉移緩沖液中平衡10min
注意:如檢測小分子蛋白,可省略此步,因小分子蛋白容易擴散出膠。

2.      依據膠的大小剪取膜和濾紙6片,放入轉移緩沖液中平衡10min。如用PVDF膜需用純甲醇浸泡飽和3-5秒鐘。

3.      裝配轉移三明治:海綿®3層濾紙®®®3層濾紙®海綿,每層放好后,用試管趕去氣泡。切記:膠放于負極面(黑色面)。

4.      將轉移槽置于冰浴中,放入三明治(黑色面對黑色面),加轉移緩沖液,插上電極,100V1h(電流約為0.3A)。注意:應再次檢查三明治和電極是否裝配正確,電源是否接通。

5.      轉膜結束后,切斷電源,取出雜交膜
**雜交與顯色

1.25 ml TBS 洗膜5min,室溫,搖動。

2.置膜于25 ml 封閉緩沖液中1h, 室溫,搖動。

3.15ml TBS/T3次(5 min/T)。

4.加入合適稀釋度的一抗,室溫孵育1-2h4°C過夜,緩慢搖動。

5.15 ml TBS/T3次(5 min/T)。

6.加入合適稀釋度的堿性磷酸酶(AP)或辣根過氧化酶(HRP)標記的二抗,室溫孵育1h,緩慢搖動。

7.15 ml TBS/T3次(5 min/T)。

8.15 ml TBS1次。

9.蛋白檢測(顯色法或發光法,按相應試劑說明操作)

注意事項:

1.操作中戴手套,不要用手觸膜。

2.PVDF膜在甲醇中浸泡時間不要超過5秒。

3.如檢測小于20kD的蛋白應用0.2µm的膜,并可省略轉移時的平衡步驟。

4.某些抗原和抗體可被Tween-20 洗脫,此時可用1.0% BSA代替Tween-20

5.關于封閉劑的選擇:5%脫脂奶/TBS or PBS: 能和某些抗原相互作用,掩蓋抗體結合能力;0.3~3% BSA in PBS:低的內源**叉反應性。

6.如用0. 1% Tween 200.02% NaN3 in PBS or TBS作封閉劑和抗體稀釋液,抗體檢測后可進行蛋白染色。

7.如要同時檢測大分子量和小分子蛋白,*好用梯度膠分離蛋白。

PVDF膜上蛋白的可逆染色

   Western雜交時,為確認蛋白是否轉至PVDF膜上,可用下列方法對膜上蛋白進行可逆性染色。

1.       氨基黑染色

染液0.5% Amido Black (w/v), 25% isopropanol (v/v) and 10% acetic acid.

染色:將PVDF膜置于染液中染色數鐘,ddH2O 脫色。

2. 考馬氏亮藍染色

染液0.1% Coomassie Brilliant Blue R-250 (w/v) and 50% methanol (v/v)

脫色液:40% methanol (v/v) with 10% acetic acid (v/v)

染色:將PVDF膜置于染液中染色15 min.,脫色液脫色。

3.麗春紅染色Ponceau S
染液:0.2% w/v Ponceau S in TCA (3% v/v)

  染色:將PVDF膜置于染液中染色5min

  脫色:ddH2O 脫色

三、銀染

PAGE膠上蛋白質的銀染方法有數百種,其原理相似,具體步驟各不相同。銀染為蛋白質的非特異性染色,呈“爆炸性”反應模式,用于蛋白定量時準確性差,但其敏感度高、簡便易行,仍被廣泛應用。下面列舉的這三種方法為常用的雙向電泳凝膠染色法,可與質譜兼容。其中方法1敏感性*高,方法3背景*低、對比度好。

1.      Blam silver staining protocol (Modified)

程序

溶液

時間

固定

 

40%ETOH

10%HAC

1小時

 

漂洗

30%ETOH

2×20min

致敏

0.02%Na2S2O3

1min

漂洗

H2O

3×20Secs

染色

0.1%AgO3(預冷)

4℃20mins

漂洗

 

H2O

H2O(更換盤子)

3×20Secs

1min

顯色

 

3%Na2CO3

0.05%甲醛

 

 

漂洗

H2O

20Secs

中止

5%Hac

 

漂洗

H2O

3×10min

貯存

1%Hac,4℃

 

2.      EMBL Silver Staining Protocol

程序

溶液

時間

固定

 

50%MeOH

5%HAc

20min

 

漂洗

H2O

2hr或過夜

致敏

0.02%Na2S2O3

1min

漂洗

H2O

2×1min

染色

0.1AgNO3 (預冷)

20min

漂洗

H2O

2×1min

顯色

 

2%Na2CO3

0.04%甲醛 

 

中止

5% HAc

 

貯存

1% HAc4℃

 

3.      Vorum Silver Staining Protocol

程序

溶液

時間

固定

 

 

 

漂洗

 

致敏

 

漂洗

染色

 

 

漂洗

顯色

 

 

中止

 

貯存

50%MeOH

12%HAc

0.05%甲醛

 

35%EtOH

 

0.02%Na2S2O3

 

H2O

0.2AgNO3

0.076%甲醛

H2O

6% Na2CO3

0.05%甲醛

0.0004% Na2S2O3

50%MeOH

12%HAc

1%HAc4℃

2hr或過夜

 

 

 

3×20mins

 

2min

 

3×5mins

20min

 

3×5mins

 

 

 

5mins

 注意事項:

1.        應嚴格按照操作步驟進行;

2.        顯色前*好更換新染色盤;

3.        顯色時變為黃色或棕色后立即棄去,更換新鮮顯色液,一般來說染一塊膠應配制500ml染液。更換2-3次;

4.        市售甲醛的濃度為37%

5.        三種方法均與質譜兼容,Blum法敏感性高,但背景呈淡黃色,EMBL法次之但背景較低,染色點較黑。Vorum相對不敏感,但背景清晰,信噪比高。

人腫瘤抗原的識別與鑒定

-**沉淀實驗流程

一、裂解細胞

1.收集細胞。將培養瓶置于冰上,倒掉培養基,用PBS或生理鹽水漂洗兩次,留適量液體于瓶內,然后用特制的細胞刮棒朝一個方向刮取細胞。將細胞懸液轉移到離心管,離心取沉淀,-800C保存。(收集細胞要迅速,低溫下進行,以減弱蛋白酶的作用)

2.裂解細胞。采用RIPA裂解體系,使用前40C預冷,按107個細胞加入1.0ml裂解液,吹打混勻,加入適量的蛋白酶抑制劑(如cocktail),冰上放置3~5分鐘。

3.超聲處理裂解液。使用探針型超聲進行多次適當頻率的短促沖擊,10~20/次,重復3次,中間間隔10~20秒,冰浴下進行。

4.15,000rpm40C離心15min,吸取上清液于另一Ep管中,置冰上。上清液用于下一步的預處理。

二、裂解物的預處理

使用正常人的血清對裂解物進行預處理。

1、按1ml裂解物加2µl對照血清的比例加入正常人血清。

2、室溫孵育2~3小時,緩慢搖動。

三、**復合物的純化

1)        Dynabeads proteinA進行**復合物的純化。

2)        Dynabeads proteinA 振蕩混勻,吸取100µl磁珠于Ep管中,置于磁鐵架(Dynal MPC)上,磁珠吸附到管壁上,棄上清。

3)        500µl 0.1M Na-phosphate (pH 8.1 )Ep管,輕柔搓動管子約2~3min,將Ep管置于磁鐵架上,磁珠吸附到管壁上,棄上清。

4)        重復2步驟兩次。

5)        清洗完磁珠后,加500µl預處理后的裂解物,反復搖動管子,室溫下反應10~20min

6)        Ep管置于磁鐵架上,磁珠吸附到管壁上,將上清轉移至另一Ep管中。

7)        RIPA裂解液清洗磁珠3次。

8)        洗脫抗原-抗體復合物。加0.1M citrate (pH3.1) 30µlEp管中,輕柔搓動管子約2~3min,將Ep管置于磁鐵架上,吸取上清于一Ep管。

9)        重復步驟7,將上清收集于同一個Ep管洗脫樣品總體積為60µl,作對照用。

10)    磁珠用 0.1M Na-phosphate (pH 8.1 ) 清洗三次后備用。

11)    在步驟5留取的上清中加入病人血清(1ml2µl血清),緩慢搖動,室溫孵育2~3h

12)    Ep管置于磁鐵架上,磁珠吸附到管壁上,棄上清。

13)    重復步驟6~8。共收集到兩份樣品,對照與病人的純化**復合物各60µl

14)    磁珠用 0.1M Na-phosphate (pH 8.1 ) 清洗三次后加入柱儲液100µl,40C保存。

15)    在樣品中加入2×SDS上樣緩沖液并用1M NaOH調節pH至使溴酚藍呈藍色。

四、1D SDS-PAGE

用**沉淀后的樣品可直接進行一維凝膠電泳,或者對磁珠上的蛋白A或蛋白G進行耦聯劑修飾,洗脫后的樣品可進行Western Blot

RIPA裂解液:150mmol/L NaCl1.0%NP-400.5%脫氧膽酸鈉;0.1%SDS50mmol/L Tris,(pH 8.0

 

 蛋白質組實驗流程

雙向電泳的樣品的制備

樣品制備原則

樣品制備是雙向電泳中*關鍵的一步,將直接影響2-DE結果好壞。目前并沒有一個通用的樣品制備方法,盡管處理方法多種多樣,但都遵循幾個基本的原則:1)盡可能的提高樣品蛋白的溶解度,抽提*大量的總蛋白,減少蛋白質的損失;2)減少對蛋白質的人為修飾;3)破壞蛋白質與其他生物大分子的相互作用,并使蛋白質處于完全變性狀態。

根據這一原則,樣品制備需要四種主要的試劑:離液劑(chaotropes),主要包括尿素(Urea)和硫脲(thiourea);表面活性劑(sufactants),也稱去垢劑,如CHAPSZwittergent系列等雙性離子去垢劑;還原劑(reducing agents),*常用的是二硫蘇糖醇(DTT)和磷酸三丁酯(TBP)等。當然,也可以選擇性的加入Tris-base,蛋白酶抑制劑以及核酸酶。

樣品的來源不同,其裂解的緩沖液也各不相同。通過不同試劑的合理組合,以達到對樣品蛋白的*大抽提。在對樣品蛋白質提取的過程中,必須考慮到去除影響蛋白質可溶性和2DE重復性的物質,比如核酸、脂、多糖等大分子以及鹽類小分子。大分子的存在會阻塞凝膠孔徑,鹽濃度過高會降低等電聚焦的電壓,甚至會損壞IPG膠條,這樣都會造成2-DE的失敗。樣品制備的失敗很難通過后續工作的完善或改進獲得補償。

核酸的去除可采用超聲或核酸酶處理,超聲處理應控制好條件,并防止產生泡沫;而加入的外源核酸酶則會出現在*終的2D膠上。脂類和多糖都可以通過超速離心除去。透析可以降低鹽濃度,但時間太長;也可以采取凝膠過濾或沉淀/重懸法脫鹽,但會造成蛋白質的部分損失。

因此,樣品制備方法必須根據不同的樣品、所處的狀態以及實驗目的和要求來進行選擇。目前有很多方法適于2-DE,如組織或細胞的總蛋白提取物、亞細胞組份或細胞器蛋白、**沉淀的蛋白及其它亞組份蛋白(如磷酸化蛋白、采用親合純化凝集素結合蛋白等)。

一、細胞樣品

1.        細胞培養,加藥與處理。

2.        胰酶消化貼壁細胞,PBS漂洗3(1500g,5min),棄上清, 再次離心,去盡殘液(非常重要!)。如要比較細胞膜蛋白組的差別,*好用細胞刮收獲細胞。如用10mM Tris/ 250 mM Sucrose(pH 7.0)代替PBS,可有效降低樣品的鹽濃度。
加入5倍體積裂解液,混勻(或將1×106細胞懸于60100µl裂解液中)。

3.        50ug/ml RNase200ug/ml Dnase,在4℃放置15分鐘。

4.        15,000轉,4℃離心60分鐘(或40,000轉,4℃離心30分鐘)。

5.        收集上清。

6.        測定蛋白濃度(采用BioRad RC/DC protein assay kit)

7.        分裝樣品,凍存于-70℃

二、組織樣品

1.      碾缽碾磨組織,碾至粉末狀。

2.      將適量粉末狀組織轉移至勻漿器,加入適量裂解液,進行勻漿。

3.      50ug/ml RNase200ug/ml DNase,在4℃放置15分鐘。

4.      15,000轉,4℃離心60分鐘(